Kada ste tek diplomirali i ušli u posao, suočeni ste s gomilom imenica koje se suočavaju s kvantitativnim PCR eksperimentima u realnom vremenu. Da li ste zbunjeni oko toga odakle da počnete? Šta je značenje krivulje pojačanja, standardne krive, praga, CT vrijednosti, krivulje topljenja i osnovne linije? Fluorescentne slike iz tih eksperimenata su previše svijetle, ali izgleda da ih ne mogu identificirati. Danas ćemo vas odvesti da naučite ova znanja i koncepte u dva dijela: tehnički termini i često postavljana pitanja.
Dio I Stručni uslovi
1. Kriva pojačanja
Kriva amplifikacije se odnosi na krivu gdje je broj ciklusa apscisa, a intenzitet fluorescencije u realnom vremenu tokom reakcije je ordinata tokom PCR-a.
2. Polazna linija
Osnovna linija se odnosi na malu promjenu fluorescentnog signala tokom prvih nekoliko ciklusa reakcije PCR amplifikacije. Nivo signala je blizu prave linije, što je osnovna linija.
3. Podešavanje praga fluorescencije
Obično se signal fluorescencije prvih 15 ciklusa PCR reakcije koristi kao pozadinski signal fluorescencije, a prag fluorescencije je 10 puta veći od standardne devijacije signala fluorescencije tokom 3-15 ciklusa PCR-a i prag fluorescencije se postavlja tokom eksponencijalne faze PCR amplifikacije. Tipično, svaki instrument ima svoj prag fluorescencije prije upotrebe.
4. CT vrijednost
CT vrijednost predstavlja broj ciklusa koji će se dogoditi za svaku PCR reakcijsku epruvetu kada fluorescentni signal dostigne postavljeni prag. Iz istraživanja znamo da postoji linearna veza između CT vrijednosti svakog predloška i logaritma početne kopije tog šablona. Što je veći početni broj kopije, to je manja CT vrijednost, i obrnuto. Koristeći standarde sa poznatim početnim brojevima kopija, može se napraviti kalibracijska kriva gdje apscisa predstavlja logaritam početnog broja kopija, dok ordinata predstavlja CT vrijednost. Stoga, sve dok se dobije CT vrijednost nepoznatog uzorka, početni broj kopija uzorka može se izračunati iz standardne krive.
znati više
Postoji nekoliko pokazatelja za procjenu da li je kriva pojačanja dobra ili ne:
Odgovor: Tačka infleksije krivulje je očigledna, posebno je očigledna eksponencijalna faza uzorka male teške frakcije, ukupni paralelizam krivulje pojačanja je vrlo dobar, osnovna linija je ravna, nema pojave porasta, a pojačanje krivulja uzorka eksponencijalne faze koncentracije niske razine je vrlo dobra. očigledno.
B: Nagib eksponencijalne faze krive je direktno proporcionalan efikasnosti pojačanja, što je veći nagib, to je veća efikasnost pojačanja.
C: Standardna osnovna linija je ravna ili se lagano smanjuje, bez vidljivog uzlaznog trenda.
D: Paralelizam krivulja pojačanja za svaku epruvetu je dobar, što ukazuje da je efikasnost amplifikacije svake reakcione cevi slična.
5. Kriva topljenja
Kada se PCR proizvod zagrije, kako temperatura raste, dvolančani proizvod amplifikacije se postepeno disocira, što rezultira smanjenjem intenziteta fluorescencije. Kada se postigne određena temperatura, velika količina proizvoda se odvaja, što rezultira naglim smanjenjem fluorescencije. Korištenje ove funkcije zajedno s različitim vrijednostima TM za različite PCR proizvode također se razlikuje u temperaturi na kojoj fluorescentni signal brzo opada, što može biti dobar način za identifikaciju PCR specifičnosti.
6. Kriva topljenja (koristeći logaritamsku krivu)
Grafikon pikova formiran je logaritmom krivulje topljenja kako bi se intuitivnije prikazala situacija fragmenata proizvoda. Budući da je temperatura topljenja TM vrijednost fragmenta DNK, mogu se odrediti određeni parametri koji utječu na vrijednost TM fragmenta DNK, kao što su veličina fragmenta, sadržaj GC, itd. Generalno, prema našem principu dizajna prajmera, obično se kaže da je dužina pojačanog proizvoda u rasponu od 80-300bp, a temperatura topljenja treba da bude između 80 stepeni i 90 stepeni.
O: Ako postoji samo jedan glavni vrh između 80 stepeni i 90 stepeni, to znači da je PCR u realnom vremenu savršen.
B: Ako se glavni vrh pojavi između 80 stepeni i 90 stepeni, a vrh nečistoće ispod 80 stepeni, u osnovi se uzima u obzir prajmer-dimer. Ovo je dobra opcija za pokušaj rješavanja podizanjem temperature žarenja.
C: Ako se glavni vrh pojavi između 80 stepeni i 90 stepeni, a lutajući vrh se pojavi kada se temperatura poveća, kontaminacija DNK se u osnovi razmatra. A DNK treba ukloniti u početnim fazama eksperimenta.
7. Standardna krivulja
Standardni standardi su razrijeđeni do različitih koncentracija i korišteni kao šabloni za PCR reakcije. Standardna kriva je iscrtana sa logaritmom standardnog broja kopije kao apscisa i izmjerenom CT vrijednošću kao ordinatom. Kada se kvantifikuje nepoznati uzorak, broj kopija uzorka može se dobiti iz standardne krive na osnovu CT vrednosti nepoznatog uzorka. Standardne krive su veoma važne za apsolutnu kvantifikaciju.
drugi dio. zajednički problem
P1: Koja je razlika između RT-PCR, QPCR, PCR u realnom vremenu i RT-PCR u realnom vremenu?
A1: RT-PCR je PCR sa reverznom transkripcijom, koja je široko korištena varijanta polimerazne lančane reakcije. U RT-PCR, RNA lanac se reverzno transkribuje u komplementarnu DNK, koja se zatim koristi kao šablon za PCR za amplifikaciju DNK pomoću PCR-a.
PCR u realnom vremenu i QPCR su ista stvar, oba su kvantitativni PCR u realnom vremenu, što znači da postoji snimanje podataka u realnom vremenu u svakom ciklusu tokom PCR procesa. Na ovaj način se može precizno analizirati broj startup šablona.
Iako se čini da su i PCR u realnom vremenu i PCR s reverznom transkripcijom skraćeni kao RT-PCR, međunarodna konvencija je da se RT-PCR posebno odnosi na PCR s reverznom transkripcijom, dok se PCR u realnom vremenu često skraćuje kao qPCR (Quantitative Real- True Real-True Real PCR ) - vremenski PCR).
RT-PCR u realnom vremenu (RT-QPCR) je vrsta PCR reverzne transkripcije koja kombinuje fluorescentne kvantitativne tehnike: prva reverzna transkripcija sa RNK za dobijanje cDNK (RT), nakon čega sledi kvantitativna analiza pomoću PCR u realnom vremenu (QPCR).
P2: Zašto je dužina amplificiranog fragmenta proizvoda fluorescentnog kvantitativnog PCR-a kontrolirana unutar raspona od 80-300bp?
A2: Dužina svake sekvence gena je različita, neki od njih su nekoliko Kb i stotine BP. Međutim, kada dizajniramo prajmer, samo trebamo zahtijevati da dužina proizvoda bude 80-300bp, a prekratka ili predugačka nije pogodna za kvantitativnu PCR detekciju.
Fragmenti proizvoda su prekratki da bi se razlikovali od prajmera-dimera. Dužina prajmera-dimera je oko 30-40bp, kada je manja od 80bp, teško je razlikovati da li je prajmer-dimer ili proizvod. Ako je fragment proizvoda predugačak i prelazi 300 bp, to će lako dovesti do niske efikasnosti amplifikacije, a količina gena se ne može efikasno otkriti.
Na primjer, kada brojite broj ljudi u učionici, trebate samo izbrojati koliko ima usta. Isto važi i za testiranje gena. Potrebno je samo otkriti određenu sekvencu gena da biste predstavili cijeli niz. Lako je pogriješiti ako brojite i usta i nos, uši i naočare za brojanje ljudi.
P3: Koja je optimalna dužina za dizajn prajmera?
O3: Općenito govoreći, dužine prajmera u rasponu od 20-24bp su dobre. Naravno, prilikom projektovanja prajmera moramo obratiti pažnju na vrednost TM prajmera, jer je ona vezana za optimalnu temperaturu žarenja. Nakon mnogo eksperimenata, dokazano je da je 60 stepeni dobra TM vrijednost. Niska temperatura žarenja može lako dovesti do nespecifičnog pojačanja, dok visoka temperatura žarenja obično dovodi do niske efikasnosti pojačanja, kasnog vrhunca krivulje amplifikacije i odgođene CT vrijednosti.
Pitanje 4: Da li količina prikupljenog uzorka utiče na eksperimentalne rezultate?
A4: Ne. Očigledno, što se više uzoraka prikupi, više se ekstrahuje RNK, više cDNK i više ciljnih fragmenata će biti. Za apsolutnu kvantifikaciju, potrebno je izračunati broj kopija ciljnog fragmenta, a količina prikupljenog uzorka će definitivno uticati na eksperimentalne rezultate. Na primjer, otkrivanje HBV virusa hepatitisa C u krvi je otkrivanje sadržaja HBV-a u određenoj količini (1 ml) krvi.
Za relativnu kvantifikaciju koja se obično koristi u naučnim istraživanjima, broj uzoraka nema nikakve veze sa eksperimentalnim rezultatima, jer se relativna kvantifikacija odnosi na poređenje između ciljnog gena i referentnog gena. Samo ih razmotrite kao uzvodne i nizvodne fragmente prisutne u istom lancu nukleinske kiseline. Ako je veličina uzorka velika, i referentni i ciljni geni se povećavaju u jednakim omjerima u isto vrijeme, što ne utječe na rezultate.
P5: Hoće li efikasnost reverzne transkriptaze uticati na eksperimentalne rezultate?
A5: Isto kao gore. Imajte na umu da želimo veću RT efikasnost, ali preferiramo da RT enzim bude relativno stabilan i da dobije ujednačene rezultate. Ovo će biti test optimizovanih mogućnosti paketa za obrnutu transkripciju velikih kompanija.
Pitanje 6: Da li efikasnost TAQ enzima utiče na eksperimentalne rezultate?
A6: Efikasnost TAQ enzima je relativno velika. Obično su potrebni taq enzimi sa vrućim startom i relativno su efikasni. Za komercijalne kvantitativne komplete za fluorescenciju, svaki proizvođač će optimizirati efikasnost najboljeg stanja prema vlastitim proizvodima blizu 100 posto, ako je efikasnost preniska, eksperimentalni rezultati se ne mogu dobiti. Za proizvode različitih kompanija ovo je mjera kvaliteta.
Pitanje 7: Da li količina fluorescentne boje utiče na eksperimentalne rezultate?
A7: Da, hoće. Ako je fluorohrom previše zasićen, može uzrokovati smetnje u buci u nekim instrumentima. Ako fluorohrom nije zasićen, a vrijednost fluorescencije je preniska, rano će ući u plato fazu i kriva pojačanja će biti ravna. U kvantitativnom eksperimentu fluorescencije uglavnom se vidi CT vrijednost, tako da nije bitno da kasna kriva amplifikacije uđe u plato fazu, ali slika nije dovoljno lijepa. Ako ste morali birati, počnite odabirom fluorohroma koji je nešto manje zasićen. Međutim, kada se koristi isti proizvod iste kompanije, njegov učinak je u osnovi zanemarljiv.
Pitanje 8: Hoće li prijenos PCR epruvete utjecati na eksperimentalne rezultate?
O8: Da. Međutim, za istu seriju potrošnog materijala istog proizvođača, ovaj efekat se može zanemariti. Ovo je dobar izbor i najbolje je koristiti 96-ploču sa membranom visoke propusnosti kako bi se smanjio efekat propusnosti svjetlosti potrošnog materijala.
P9: Da li će greške tokom rada uticati na eksperimentalne rezultate?
A9: Uticaj procesa rada uglavnom se ogleda u uniformnosti. Homogenost znači da su sve komponente u sistemu ravnomjerno pomiješane zajedno, a flash centrifugiranje može riješiti ovaj problem. Osim toga, za početnike je najbolje podesiti PCR sistem da bude veći od 20 inča, a premali sistem skloniji je greškama. Ako je temperatura žarenja pravilno optimizirana, učinak koncentracije prajmera na CT je minimiziran. I znat ćete da se neke operativne greške (kao što je koncentracija prajmera) mogu izbjeći optimizacijom temperature žarenja.
Rezimiraj
Gore su neka pitanja i pitanja sa kojima se početnici često susreću tokom eksperimenta, nadamo se da će vam ova pitanja pomoći da riješite neku zabunu. Eksperimentiranje je proces stvaranja haosa i rješavanja problema, nadamo se da ćete nešto izvući iz toga. Hvala na čitanju i vidimo se sljedeći put!
