Tumačenje principa detekcije nukleinske kiseline

U postepidemijskoj eri, pojam "testiranje nukleinske kiseline" svima nam je poznat i postao je dio našeg svakodnevnog života.

Dakle, znate li kako testiranje nukleinske kiseline otkriva viruse? I kako testiranje nukleinske kiseline nevidljive viruse čini "vidljivim"?

01 Šta je nukleinska kiselina

Nukleinska kiselina je opšti naziv za DNK i RNK.

Nukleinska kiselina je esencijalna komponenta svih poznatih života na Zemlji. DNK za koju često kažemo da je deoksiribonukleinska kiselina. Genetski materijal novog koronavirusa je RNA - ribonukleinska kiselina.

Testiranje amplifikacije nukleinske kiseline

02 Šta tačno otkriva testiranje nukleinske kiseline?

Supstanca za detekciju nukleinske kiseline je nukleinska kiselina virusa.

Novi koronavirus je virus koji sadrži samo RNK, a specifična sekvenca RNK u virusu je marker koji razlikuje virus od drugih patogena. Detekcija nukleinske kiseline je utvrđivanje ima li nukleinske kiseline stranog virusa u respiratornom uzorku ili krvi pacijenta kako bi se utvrdilo je li zaražen novim koronavirusom. Velika većina trenutne detekcije nukleinske kiseline novog koronavirusa koristi fluorescentnu kvantitativnu PCR metodu za amplifikaciju ciljne sekvence virusne RNK pomoću PCR-a nakon reverzne transkripcije.

PCR, ili lančana reakcija polimeraze, je tehnika molekularne biologije koja se koristi za amplifikaciju specifičnih DNK fragmenata; odnosi se na reakciju specifičnih gena kataliziranu DNK polimerazom ili Reakcija brze in vitro amplifikacije DNK sekvenci se također naziva in vitro amplifikacija gena. Fluorescentna kvantitativna PCR tehnologija je dodavanje fluorescentnog reporterskog sistema u PCR reakcijski sistem i korištenje promjene fluorescentnog signala za praćenje PCR procesa u realnom vremenu, kako bi se ostvarila kvantitativna detekcija početnog šablona.

Da bi se otkrila nukleinska kiselina, prvi korak je sakupljanje uzorka. Trenutno, najkonvencionalnija metoda uzorkovanja je: upotreba briseva grla ili nosnih briseva za brisanje i sakupljanje gornjih respiratornih puteva (ždrijela ili nosne šupljine); prikupljeni uzorci će biti strogo zatvoreni, a zatim poslati u laboratoriju na postepeno ispitivanje.

1. Ekstrakcija virusne RNK

RNK virusa se prvo ekstrahuje iz uzorka. Dodajte reagense za ekstrakciju nukleinske kiseline u uzorak kako biste uništili virus i oslobodili nukleinsku kiselinu.

2. "Reverzna transkripcija" virusne RNK u cDNK

Kroz tehnologiju reverzne transkripcije (RT), RNK virusa se "preokreće" u specifičnu DNK koju je pogodnije otkriti, odnosno cDNK.

3. Amplifikacija i detekcija cDNK

U stvari, bilo da se radi o brisu grla, nosu ili čak uzorku krvi, sadržaj virusa u uzorku je relativno nizak, čak i kod teško zaraženih pacijenata (virusno opterećenje je veliko); jer su čestice virusa premale i volumen uzorkovanja ograničen, broj virusa sadržanih u uzorku je još uvijek premali za detekciju nukleinske kiseline.

Stoga, korištenjem PCR tehnologije, inspektori pojačavaju jedinstvenu "lozinku" novog korona virusa u uzorku do tačke u kojoj ga oprema može otkriti, kako bi ocijenili radi li se o pozitivnoj infekciji. Cijeli proces hvatanja genetskog materijala virusa je poput pecanja. Udica će prepoznati i zgrabiti je, tako da virus nema gdje da se sakrije.

Jednostavno rečeno, to je da se poveća broj cDNK, tako da se cDNK kontinuirano replicira, tako da broj raste eksponencijalno.

Standardni PCR proces podijeljen je u tri koraka:

Denaturacija: Upotreba visoke temperature za razdvajanje dvostrukih lanaca DNK. Vodiničke veze između dvostrukih lanaca DNK se prekidaju na visokoj temperaturi (93 - 98 stepen ).

Žarenje: Nakon što se dvolančani DNK razdvoje, temperatura se snižava kako bi se prajmerima omogućilo da se vežu za jednolančanu DNK.

Ekstenzija: DNK polimeraza sintetiše komplementarni lanac duž lanca DNK od vezanog prajmera kada se temperatura spusti. Kada je elongacija završena, jedan ciklus je završen i broj fragmenata DNK se udvostručuje. Ponovite ova tri koraka 25-35 puta i broj fragmenata DNK će se eksponencijalno povećati.

PCR dvolančani šablon

Dok se cDNK umnožava, fluorescentne sonde u kompletu rade istovremeno. Otpustit će fluorescentni signal i svaki put kada se cDNK pojača, fluorescentni signal će se malo povećati, a PCR detektor može zabilježiti Ct vrijednost povećanja fluorescentnog signala.

Vrijednost Ct je važan pokazatelj za procjenu da li je nukleinska kiselina virusa negativna ili pozitivna. Što je manje početne DNK, potrebno je više PCR ciklusa da bi se dostigao određeni prag, a Ct vrijednost je veća. Suprotno tome, što je više početne DNK, to je niža vrijednost Ct. Početna količina DNK odražava količinu virusne RNK u uzorku, što zauzvrat odražava količinu virusa u uzorku. Stoga, ako vrijednost Ct nije otkrivena ili je viša od određene vrijednosti, tada se sumnjivi pacijent smatra negativnim; ako je niža od ove vrijednosti, tada se sumnjivi pacijent smatra pozitivnim.

U toku PCR reakcije, izbor potrošnog materijala za PCR je takođe jedan od najvažnijih faktora koji utiču na rezultate detekcije nukleinskih kiselina.