1. Oporavak ćelije
Nakon što su kriokonzervirane ćelije uklonjene iz tečnog azota, one su odmrznute uz stalno mućkanje u vodenom kupatilu na 37 stepeni. Prebacite odmrznute ćelije u epruvetu za centrifugiranje, dodajte prethodno zagrejan DMEM kompletan medijum na 37 stepeni (od čega je oko 10 procenata fetalnog goveđeg seruma), lagano ravnomerno duvajte, centrifugirajte na 500 g 2 min i bacite supernatant.
Dodajte DMEM kompletan medijum za pranje i bacite supernatant. Dodajte kompletan medij DMEM, pažljivo promiješajte pipetiranjem, napravite suspenziju stanica, inokulirajte je u petrijevu zdjelu/bocu i kultivirajte u ćelijskom inkubatoru koji sadrži 5 posto CO2.
2. Prolaz ćelije
Kada gustina ćelija dostigne 80% ~90% (preuranjeni prinos je nedovoljan, prekasne ćelije su u lošem stanju, subkultura u omjeru od 1:2 do 1:10 ili više, općenito 1:3 do 1:5 generacija ćelija, odnosno od ćelijske inokulacije U vrijeme odvajanja i rekultivacije, kompletan medij je uklonjen i dva puta ispran sa 1X PBS.
Dodajte tripsin (napomena: količina rastvora za varenje je najbolja da pokrije ćelije, a optimalna temperatura varenja je 37 stepeni. Posmatrajte ćelije pod mikroskopom: posmatrajte digestirane ćelije pod obrnutim mikroskopom, ako je citoplazma povučena, ćelije više nisu međusobno povezani. Kriške, koje ukazuju na to da su ćelije u ovom trenutku pravilno probavljene), probavite ih i stavite u ćelijski inkubator na oko 2-3 minuta.
Dodajte odgovarajuću količinu DMEM kompletnog medijuma da zaustavite tripsinizaciju, prebacite u epruvetu za centrifugiranje i centrifugirajte na 500 g 2 min, bacite supernatant, dodajte DMEM kompletan medijum za pranje i bacite supernatant.
Dodajte DMEM kompletnu podlogu, promiješajte nježnim pipetiranjem, pipetirajte 10 mikrolitara za brojanje, a zatim nastavite s kultiviranjem u ćelijskom inkubatoru koji sadrži 5 posto CO2 prema potrebnoj zapremini ćelije.
3. Krioprezervacija ćelija
Kada gustina ćelija dostigne 80 posto ~90 posto, uklonite kompletan medijum i isperite 2 puta sa 1X PBS. Dodajte tripsin za varenje i stavite u ćelijski inkubator oko 2-3 min. Dodajte DMEM kompletan medijum da zaustavite varenje tripsina, prebacite ga u epruvetu za centrifugiranje i centrifugirajte na 500 g 2 min, bacite supernatant, dodajte DMEM kompletan medijum za pranje i bacite supernatant. Dodajte 1 ml otopine za zamrzavanje (90 posto fetalnog goveđeg seruma, 10 posto DMSO. Uopšteno govoreći, sadržaj seruma se može podesiti između 10 posto i 90 posto. Dodavanje seruma u otopinu za zamrzavanje može osigurati hranjive tvari za ćelije s jedne strane, a može Obezbedite nepropusne zaštitne supstance tokom krioprezervacije ćelije, kao što su saharoza, albumin, itd. za bolju zaštitu ćelija), stavite u epruvetu za krioprezervaciju (u epruveti se nalazi izopropil alkohol da obezbedi brzinu smanjenja temperature), stavite odmah Zamrznite u frižideru na 4 stepena 30 minuta, zatim stavite u frižider na -20 stepeni na 30 minuta, a zatim stavite u frižider na -80 stepeni preko noći.
Sutradan ga stavite u tečni azot, može se čuvati najmanje dve godine, a ako ga ne stavite u tečni azot, može se čuvati tri meseca.
Princip krioprezervacije i oporavka ćelija je: sporo zamrzavanje i odmrzavanje, što je pogodnije za održavanje vitalnosti ćelije. Krioprezervacija ćelija bez ikakvog zaštitnog sredstva dovešće do proizvodnje intracelularnih kristala leda, koji će izazvati endogena mehanička oštećenja ćelija, izazvati promene u osmotskom pritisku unutarćelijskog okruženja, pH, elektrolita, itd., a zatim potaknuti smrt ćelije.
4. Stvari kojima je potrebna pažnja
(1) Prethodno zagrevanje rastvora kulture: stavite pripremljenu bocu koja sadrži rastvor kulture, PBS i tripsin u vodeno kupatilo od 37 stepeni da se prethodno zagreje;
(2) Koristite 75 posto alkohola da obrišete ultra čist radni sto i ruke koje su ozračene ultraljubičastim zracima;
(3) Pravilno postavljanje korišćenih instrumenata: obezbediti dovoljan radni prostor, koji ne samo da je lak za rukovanje, već i smanjuje zagađenje;
(4) Upalite alkoholnu lampu: imajte na umu da plamen ne bi trebao biti premali;
(5) Strogi aseptični rad;
(6) Umjerena probava adherentnih ćelija: Na vrijeme digestije utiču mnogi faktori kao što su vrsta rastvora za varenje, vrijeme pripreme i količina dodata u bocu za kulturu. Tokom procesa varenja treba obratiti pažnju na promjene u obliku kultiviranih ćelija. Jednom kada se citoplazma smanji, ako se veza olabavi, ili postoje znaci plutanja u komadima, probavu treba odmah prekinuti;
(7) Sve radnje na propuštenim ćelijama treba da budu što bliže plamenu alkoholne lampe. Najbolje je raditi samo sa jednom ćelijom istovremeno, koristeći jedan set opreme za svaku ćeliju. izbjegavajte unakrsnu infekciju;
(8) Ušće boce prolazne ćelije potrebno je sterilisati na alkoholnoj lampi svaki put kada se otvori ili zatvori.
