1. U pločicu za kulturu natopite stakalce na koje se penje sa PBS tri puta po 3 minute svaki put.
2. Fiksirajte stakalce sa 4 procenta paraformaldehida na 15 minuta i potopite stakalce u PBS 3 puta, svaki put po 3 minuta.
3. Permeabilizirati sa 0.5 posto Triton X-100 (pripremljen u PBS) 20 minuta na sobnoj temperaturi (za antigene eksprimirane na ćelijskoj membrani, ovaj korak je izostavljen).
4. Blokiranje seruma: uronite stakalce u PBS 3 puta po 3 min svaki put, osušite PBS upijajućim papirom, dodajte normalni kozji serum (pod uslovom da je sekundarni izvor antitijela kozja) na stakalca i blokirajte na sobnoj temperaturi za 30 min.
5. Dodajte primarno antitelo: Upijajte rastvor za blokiranje upijajućim papirom, nemojte prati, dodajte dovoljnu količinu razblaženog primarnog antitela na svako stakalce i stavite ga u vlažnu kutiju, inkubirajte na 4 stepena preko noći.
6. Dodajte fluorescentno sekundarno antitijelo: uronite stakalce u PBST 3 puta, svaki put po 3 minute, apsorbirajte višak tečnosti na pločicama upijajućim papirom, dodajte razrijeđeno fluorescentno sekundarno antitijelo u kapima, inkubirajte na 20-37 stepenu 1h u mokroj kutiji, potopiti u PBST Slice 3 puta, svaki put po 3 min.
Napomena: Od dodavanja fluorescentnog sekundarnog antitijela, sve naredne korake treba izvoditi na tamnom mjestu što je više moguće.
7. Blokiranje seruma: obrišite tečnost upijajućim papirom, ispustite normalan kozji serum na staklo (pod uslovom da je sekundarni izvor antitela kozje) i blokirajte na sobnoj temperaturi 30 minuta.
8. Dodajte primarno antitelo: Upijajte rastvor za blokiranje upijajućim papirom, nemojte ga prati, a zatim u kapima dodajte razblaženo primarno antitelo i inkubirajte preko noći u vlažnoj kutiji od 4 stepena u mraku nakon dodavanja primarnog antitela. (Napomena: vrsta drugog primarnog antitijela se razlikuje od vrste prvog primarnog antitijela, kao što su miš i zec)
9. Dodajte fluorescentno sekundarno antitijelo: uronite stakalce u PBST 3 puta, svaki put po 3 minute, apsorbirajte višak tečnosti na pločicama upijajućim papirom, dodajte razrijeđeno fluorescentno sekundarno antitijelo u kapima, inkubirajte na 20-37 stepenu 1h u mokroj kutiji, potopiti u PBST Slice 3 puta, svaki put po 3 min. (Napomena: Ako je crvena fluorescencija odabrana za detekciju prvog antitijela, drugo mora odabrati druge boje fluorescencije)
10. Kontrabojenje jezgara: DAPI je dodat u kapima i inkubiran u mraku 5 minuta, uzorci su obojeni, a višak DAPI je ispran sa PBST 5 min×4 puta.
11. Osušite tečnost na stakalcu upijajućim papirom, zapečatite predmet sa tečnošću za montažu koja sadrži sredstvo za gašenje fluorescencije i posmatrajte i sakupljajte slike pod fluorescentnim mikroskopom.
