Danas ćemo razgovarati o ključnom elementu u PCR eksperimentima - potrošnom materijalu. Kao česti posjetitelj PCR-a, potrebno je razumjeti karakteristike i terminologiju koja se odnosi na PCR potrošni materijal.
Na tržištu postoji širok izbor potrošnog materijala za PCR, uključujući brendove, specifikacije, boje itd., koji su zadivljujući. Hajde da to razumemo korak po korak.
pcr ploča
1. Materijali
Obično je sirovina za PCR potrošni materijal polipropilen. To je dobar inertni materijal otporan na toplinu. Raspon radne temperature je od -30 do 140 stepeni, što mu omogućava da izdrži promjene toplotne energije tokom termičkog ciklusa PCR reakcije, i igra dobru ulogu u zatvaranju i zaštiti supstanci u PCR reakcijskom sistemu.
Saznajte više o polipropilenu
2. Boja
Uobičajene su bijele epruvete i prozirne PCR epruvete. U tradicionalnim PCR eksperimentima, nema razlike između njih. Međutim, u istom eksperimentu u realnom vremenu/qPCR, bijele cijevi su bile relativno osjetljivije i konzistentnije za qPCR instrumente s apikalnim očitanjima signala (vidi slike A i B ispod). zašto je ovako?
pcr tube
O: niže vrijednosti Ct za bijele cijevi u odnosu na prozirne cijevi; B: bolja ponovljivost sa bijelim cijevima.
Osnovni podaci qPCR-a su Ct vrijednost, a fluorescentni signal je izvor podataka za izračunavanje Ct vrijednosti, tako da je vrlo važno da li se fluorescencija u cijevi može u potpunosti prenijeti na detektor. Bijeli zid cijevi sprječava da fluorescencija prođe kroz zid cijevi i prelama se (slika A ispod), čime se sprječava da se fluorescencija prenese na grijaći blok (tj. zid metalne rupe gdje je cijev postavljena) i da se apsorbira ili nedosljedno reflektira blok. Jači i koncentrisaniji fluorescentni signal prikupljen je na vrhu bijele cijevi u odnosu na prozirnu cijev (slika B ispod).
pcr tube
O: Trend promjene fluorescentnog signala u providnoj cijevi i bijeloj cijevi; B: Poređenje intenziteta fluorescencije nakon dodavanja iste količine fluoresceina.
Dakle, ako koristite qPCR instrument s najboljim očitavanjem, isprobajte bijele cijevi.
3. Kvalitet (Lean or Not Lean)
Ovdje je naglašena važnost kvaliteta potrošnog materijala. qPCR potrošni materijal mora biti bez zagađivača i inhibitora. Visok pritisak i zračenje uklanjaju bakterije i DNaze, ali ne i prašinu i ostatke DNK, koji mogu inhibirati PCR reakcije ili proizvesti nespecifično pojačanje. Supstance imaju apsorpciju, pa čak i sićušni zagađivači apsorbuju fluorescenciju u reakcionom sistemu i utiču na prikupljanje fluorescentnih signala. Preuveličana verzija eksperimenta je korištena da se demonstrira učinak kontaminacije nečistoćama na eksperiment. Kao što je prikazano na donjoj slici, nečistoća je stavljena u jedan od reakcionih bunara oktave. Kao što se i očekivalo, krive amplifikacije su pokazale izražene anomalije.
Nečistoće u PCR reakcijskim epruvetama
↑ Nečistoće u reakcijskoj cijevi
8 traka
↑ Ponovljeni rezultati reakcije za 8 epruveta, nečistoća lijevog bunara "odstupa" od krive.
Podsjetnik: Pazite da potrošni materijal ne izlažete zraku duže vrijeme. Nakon što izvadite potrošni materijal, brzo zatvorite vrećicu za pakovanje kako je ne biste dodirivali golim rukama. Ako je moguće, radite na čistoj klupi.
4. Kapacitet / Veličina / Flux
Volumen određuje koliko uzorka (reakcionog volumena) može biti učitano. Predoziranje može dovesti do smanjene efikasnosti prenosa toplote, prosipanja ili unakrsne kontaminacije; premalo doziranja može dovesti do gubitka uzorka isparavanjem. Blok grijanja qPCR instrumenta također će odrediti primjenjive potrošne materijale i primjenjivu veličinu reakcionog sistema. Propusnost je lako razumljiva, to je maksimalni broj uzoraka koji se može učitati u jednom eksperimentu. Uobičajene specifikacije kapaciteta i fluksa prikazane su u donjoj tabeli:
Jedna cijev/osam redova {{0}}.2mL, 0.1mL
{{0}}ploča sa bunarima 0.2mL, 0.1mL
{{0}}ploča sa bunarima 0,2mL
Specifikacije kapaciteta su također općenito podijeljene na standardne i niske tipove, kao što je prikazano u nastavku. Potrošni materijal niskog profila ima manju visinu. Ovaj kratki dizajn minimizira prostor iznad reakcionog sistema ("mrtva zapremina" - beskorisni deo), smanjuje efekte isparavanja tokom termičkog ciklusa i omogućava modulu grejanja da se omota oko njega u većoj meri kako bi se poboljšala efikasnost prenosa toplote. Stoga su cijevi niskog profila poznate i kao "brze" cijevi ili ploče.
pcr tube
Podsjetnik: Uobičajena zapremina reakcije je 20 µL, a preporučuje se korištenje reakcione cijevi male zapremine od 0,1 mL ili male zapremine.
5. Debljina zida
Debljina stijenke cijevi direktno utiče na toplinsku provodljivost. Potrošni materijal za PCR treba da ima ujednačenu debljinu zida kako bi se obezbedio dosledan prenos toplote. Ultra-tanka stijenka cijevi je 50 posto tanja od standardne verzije, što dodatno smanjuje termičku barijeru i donosi brže i bolje efekte odziva. Stoga, kako bi se maksimizirala efikasnost PCR reakcija i osigurale stabilne i efikasne reakcije, ujednačeni i ultra-tanki PCR potrošni materijali su najbolji izbor.
6. Transparentnost
Poklopci i zaptivne folije za qPCR zahtijevaju visoku optičku jasnoću kako bi se osigurala optimalna penetracija i prijenos fluorescentnih signala uz smanjenje izobličenja (za qPCR instrumente koji se čitaju na vrhu). Što je veća prozirnost stijenke cijevi, to može utjecati na eksperimentalne rezultate. Razlog je objašnjen gore. Tradicionalni PCR može zanemariti ovu osobinu.
7. Suknje
Rub PCR ploče odnosi se na periferni nastavak ploče. Pri izgradnji reakcionih sistema, suknja deluje kao stabilna podrška za procese pipetiranja i obezbeđuje mehaničku čvrstoću i prianjanje u kombinaciji sa automatizovanim radnim stanicama. Postoje tri uobičajena tipa suknji, polusuknje i pune suknje (odgovaraju A, B i C na slici ispod).
Skirtless: Može se koristiti sa većinom PCR ili qPCR instrumenata, ali ne i za automatske aplikacije. Lako se pomera tokom pipetiranja, nije baš stabilno, potrebno je koristiti sa držačem ploče.
Polu suknje: Idealno za automatizovane aplikacije sa dobrom stabilnošću pipetiranja.
Puna podloga: Idealna za automatske aplikacije. Dobra mehanička čvrstoća, pogodna za PCR instrumente sa izbočenim modulima, visoka stabilnost tokom pipetiranja.
pcr ploča
Savjeti: Značaj suknje je više u olakšavanju industrijalizacije i automatizirane serijske obrade, u kombinaciji s robotskom rukom. Možda neće biti potreban u tradicionalnim istraživačkim laboratorijama, nijedna suknja nije dovoljna.
pcr ploča
8. Parafilm
Zaptivni film za PCR ploče izrađen je od prozirne plastične ili aluminijske folije. Ljepljivi prozirni filmovi su češći, pogodni za ploče sa 96 ili 384 jažica, i trebali bi imati dovoljno dobru propusnost svjetlosti. Prilikom zaptivanja filma, mala kartica će se koristiti za pritiskanje filma oko otvora za brtvljenje kako bi se izbjeglo curenje zraka.
Ljepljive aluminijske folije mogu biti manje uobičajene. Iako nije pogodan za qPCR, idealan je potrošni materijal za uzorke osjetljive na svjetlost. Budući da se može bušiti, olakšava prijenos uzorka u PCR-u (za konvencionalni PCR).
Zaptivni film za PCR ploče
Rezimiraj
Kao nosilac PCR sistema, potrošni materijal je veoma važan za poboljšanje kvaliteta eksperimentalnih podataka. Nadam se da vam ovo dijeljenje može pomoći da shvatite neke savjete o PCR potrošnom materijalu i pružite pomoć za bolji odabir potrošnog materijala.